實驗目的

對真菌細胞進行破壁,，提取其DNA,。

實驗原理

隨著分子生物學技術的進展,，PCR相關方法越來越多地被應用到真菌學研究中來,，而真菌DNA的提取是包括分子診斷在內的所有實驗的基礎,，簡便快捷地提取真菌DNA,，且獲得的DNA完整,、純度高,，對真菌分子生物學的研究有及其重要的意義,。

真菌細胞壁以幾丁質、葡萄糖為主構成細胞壁骨架，而基質則由多糖,、甘露聚糖,、糖蛋白、脂質等填充,。絲狀真菌堅韌厚壁的構成,，需要較為繁瑣的破壁手段，故真菌DNA的提取較細菌或其他組織細胞難度更大,。為保證真菌PCR技術及其相關分子生物學技術的順利開展,，簡便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整,、純度高,，是必須解決的前提條件。

實驗材料和器具

樣品：真菌類

儀器：高通量組織研磨儀（上海凈信,，Tissuelyser-48）

耗材：離心管（上海凈信,，0.4研磨單位），研磨珠（上海凈信,，6號,，1顆）

試劑：TE Buffer，DA Buffer,，E Binding Buffer,，Elution Buffer

實驗步驟

方法1

1.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中，加0.08mlTE Buffer,，加入石英砂100mg,；

1.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設置頻率13單位振頻,，研磨10min,；

1.3 取出離心管于65°C環(huán)境中溫浴30min，然后移出,；

1.4 加入0.65mlDA Buffer,，混合均勻后于冰浴中放置5min；

1.5 放入離心機14000r/min離心3min,；

1.6 將上清液轉移到一個新的0.5研磨單位離心管中,，加0.15ml的E Binding Buffer，并混合均勻,，將混合液體轉移至Spin column,；

1.7 放入離心機6000r/min離心1min，棄去接液管中液體,；

1.8 Spin column中加入0.12ml的Wash Buffer,，于10000r/min離心30s,，棄去接液管中液體；

1.9 重復步驟1.8,，棄去接液管中液體后,，再10000r/min離心60s，Spin column轉到新的EP管中,；

1.10 Spin column中加入0.03ml Elution Buffer,，室溫放置1min。12000 r/min離心60s,，并棄去Spin column,。

方法2

2.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中，加0.08ml10×TE Buffer,，加入石英砂100mg,；

2.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設置頻率60hz,，研磨2-3min,；

2.3 加入0.024ml10%SDS，加入0.002ml蛋白酶K,，混勻,，65°C環(huán)境中水浴30min；

2.4 然后渦旋1min,，加入0.024ml5M NaCl,，加入1/10體積的10%CTAB（約0.013ml）；2.5 于65°C水浴60min,，渦旋1min,；

2.6 抽提，加入1/2體積（約0.07mi）的Tris飽和酚及1/2體積（約0.07ml）的氯仿：異戊醇（24:1）,，混勻,；

2.7 于離心機14000轉離心1min，取上清液到另一離心管中,；

2.8 重復步驟2.7 2-3次（視兩相界面雜質多少而定）,。

2.9 加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混勻，14000轉離心10min,，取上清液至另一離心管中,；

2.10 后開始沉淀，加入0.045ml NH4Ac,，輕柔混勻,，冰水中放置30min，加入0.6倍體積的異丙醇,，混勻,，14000轉離心10min,，棄上清液,；

2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀,，室溫晾干，加0.04ml TE Buffer溶解沉淀,。